표본 수집 및 보존
일반적으로 ELISA 검사에 사용할 수 있는 샘플 유형에는 혈청, 혈장, 소변, 세포 배양 상청액, 조직 균질 등 여러 가지가 있습니다. 테스트 샘플 유형에 따라 전처리 방법이 다릅니다. 샘플을 올바르게 처리하는 것은 ELISA 테스트의 정확성과 정확성을 보장하는 첫 번째 단계입니다. 다음은 여러 유형의 샘플 처리 방법에 대한 간략한 설명입니다.
혈청
혈청은 ELISA 검사에서 가장 많이 사용되는 샘플로, 처리가 비교적 간단하다.
무열원, 내독소가 없는 시험관이나 원심관으로 혈액 샘플을 채취해 시험관이나 원심관을 실온에서 2 시간 또는 4 C 밤을 두어 혈청을 침전시킨다. 시험관이나 원심관을 기울여 액면 횡단면을 늘리면 혈청이 더 많이 가라앉는다. ) 4℃ 1000×g 원심 분리 20min, 상청액을 조심스럽게 수집한다. 혈청을 여러 부분으로 나누어-20 C 또는-80 C 아래에 보관하는 것이 좋습니다.
혈혈 과정에서 용혈을 피해야 한다. 적혈구가 용해될 때 과산화물 효소 활성을 가진 물질을 방출하고 HRP 마크의 ELISA 검사에서 비특이적 발색이 발생해 검출이 정확하지 않기 때문이다. 세균 오염도 피해야 한다. 세균에는 내원성 HRP 가 들어 있을 수 있어 위양성 검사를 받을 수 있기 때문이다.
혈장
혈관이나 항응고제를 함유한 원심관으로 혈액 샘플을 채취한 후 30 분 이내에 4 C 원심 1000×g 15 분 동안 청액을 혈장으로 채취한다. 상청액을 여러 부분으로 나누어 -20℃ 또는-80 ℃에 보관하여, 반복적으로 얼지 않도록 한다. 용혈성이나 고지혈증 샘플을 사용하지 마십시오.
일반적으로 사용되는 항응고제는 EDTA, 헤파린 나트륨, 레몬산 나트륨 등이다. 검사 시 테스트 키트 설명서를 꼼꼼히 읽어 테스트 키트 대항제에 대한 특수한 요구 사항이 있는지 점검해야 한다.
세포가 청액을 배양하다
세포 배양 상청액을 원심관, 1000×g 원심 20min 으로 가져와 세포 파편과 불순물을 제거하고 청액을 -20℃ 또는 -80℃ 에 저장하여, 반복적인 융해를 피한다.
세포 분열물
1) 배양판에서 배양기를 흡수하고, 췌단백질소로 세포를 소화하고, 적당량의 배양기를 넣어 세포를 배양판에서 날려 버린다. 공중부양 세포는 생략할 수 있다.
2) 세포 현액 수집, 1000×g 원심 10 분, 배양기 폐기, 예냉 PBS 로 세 번 촉촉하게 적셔 주세요.
3) 적당량의 예냉된 PBS 또는 세포 분해물 (사용하기 전에 단백질효소 억제제 추가) 을 넣어 세포를 다시 정지시킵니다. 일반적으로 6 오리피스 구멍의 한 구멍에 있는 세포의 양은 150~250μL PBS 를 필요로 합니다.
4) 샘플을 -20℃ 또는-80 ℃에 넣고 다시 실온해동하고 여러 번 냉동하여 세포가 충분히 분해되도록 한다. 초음파를 통해 샘플을 분쇄하여 파열의 목적을 달성할 수도 있다.
5)4℃ 원심 분리 10000×g 10 분, 세포 파편 제거, 청액 제거, -20℃ 또는-80 ℃에 보관, 반복 동결 융해를 피하십시오.
조직균질
1) PBS (0.0 1M, PH 7.4) 로 조직 샘플을 씻어서 조직 표면에 남아 있는 혈액이나 불순물을 씻어낸다.
2) 조직 블록을 가져 와서 기록하고 조각으로 자른다. 조각이 작을수록 좋다. 그래야 골고루 더 충분할 수 있다.
3) 조직을 일정한 비율에 따라 예냉한 PBS (사용 전에 단백질효소 억제제 추가) 를 넣어 고르게 하고, 균질할 때 얼음이나 얼음욕에 놓는다. (일반적으로 조직 중량: PBS 부피는 1: 9 와 같습니다. 예를 들어 1g 조직 샘플은 9mL PBS 에 해당하며, 구체적인 부피는 실험에 따라 적절히 조정할 수 있으며, 테스트 후 샘플 농도에 해당 희석 배수를 곱해야 합니다.)
4) 4 C 5000× G 원심력 5~ 10min 을 원심관에 고르게 빨아들여-20 C 또는-80 C 에 보관하여, 반복적인 융해를 피한다.
소변, 타액 및 기타 액체 생물학적 샘플
1000×g 원심 20min 으로 청액 검사를 받으십시오.
일반적으로 ELISA 는 수용성 단백질의 함량만 감지할 수 있기 때문에 모든 샘플이 맑은 액체인지 확인하고 원심분리기를 통해 침전물이나 부유물을 제거해야 한다.
검사의 정확성을 보장하기 위해-20 C 또는-80 C 에 저장된 샘플은 1~6 개월 이내에 검사해야 합니다. 4 C 에 저장된 샘플은 1 주 내에 검사해야 합니다.
또한 샘플에 NaN3 이 포함되지 않도록 해야 합니다. NaN3 은 HRP 의 활성화를 억제하여 가짜 음성 결과를 초래할 수 있기 때문입니다.
시약 준비
테스트 키트 설명서의 요구에 따라 실험에 필요한 시약 준비를 하세요. ELISA 에서 사용되는 증류수 또는 탈 이온수, 세탁을 포함해서 신선하고 고품질이어야 합니다. 수제 완충액 및 세정액은 산도계로 측정됩니다. 냉장고에서 꺼낸 검사 시약 온도는 온도와 실온이 균형 잡힌 후에 사용해야 하며 실온 균형은 일반적으로 30min 이상이다. 테스트 키트 중 필요 없는 부분은 제때에 냉장고에 넣어 보관해야 한다.
가형
ELISA 에서, 가형은 일반적으로 세 단계, 즉 가형, 가효소 결합물, 가저물이다. 견본을 추가할 때, 추가하는 물질은 레사판 구멍 바닥에 추가되어야 하며, 구멍 벽의 윗부분에 추가되지 않도록 해야 하며, 넘치거나 거품이 생기지 않도록 주의해야 한다.
표본은 일반적으로 미량 샘플러로 첨가하고, 규정된 양대로 판구멍을 넣는다. 매번 샘플을 추가할 때마다 흡입구를 교체하여 교차 오염을 피하거나 일회용 정량 플라스틱 파이프로 샘플을 추가할 수 있습니다 (일반적으로 권장하지 않음). 일부 지표 (예: 간접 ELISA) 는 혈청을 희석해야 하며 시험관에서 규정된 희석도에 따라 희석한 후 샘플을 추가할 수 있다. 판구멍에 희석액을 넣고 혈청 샘플을 넣은 다음 마이크로흔들림에 1min 을 고르게 흔들 수도 있습니다. 효소 결합물 작업액과 기질 작업액을 추가할 때 다중 채널 이동기를 사용하여 가액 과정을 최단 시간 내에 완성할 수 있습니다.
열절연
ELISA 에는 일반적으로 샘플과 효소 결합물을 첨가한 후 두 가지 항원 항체 반응이 있다. 항원 항체 반응의 완성에는 일정한 온도와 시간이 필요하다. 이 보온 과정을 부화라고 하며, 어떤 사람들은 부화라고 부른다.
ELISA 는 고체상 면역 분석으로 항원과 항체 조합이 고체상 표면에서만 발생한다. 항체 가방의 샌드위치법을 예로 들어 보겠습니다. 판공을 넣은 샘플에서 모든 항원이 동일한 고상항결합 기회를 가진 것은 아니며, 구멍 벽에 가장 가까운 용액 중의 항원만이 항체 () 와 직접 접촉한다. 이것은 점차적으로 균형 잡힌 과정이므로 반응의 종점에 도달하기 위해서는 확산이 필요합니다. 효소 항체 및 고체상 항원의 결합도 마찬가지입니다. 이것이 ELISA 가 항상 부화하는 데 시간이 걸리는 이유이다.
부화에 일반적으로 사용되는 온도는 43 C, 37 C, 실온, 4 C (냉장고 온도) 입니다. 37 C 는 실험실에서 자주 사용하는 온도이자 대부분의 항원과 항체 결합에 적합한 온도이다. ELISA 방법을 확립하여 반응동력을 연구할 때, 두 가지 항원 항체 반응은 보통 37 C 에서 1-2 시간이 걸리며, 산물은 최고점에 이를 수 있다. 반응 속도를 높이기 위해 반응 온도를 높일 수 있다. 어떤 실험은 43 C 에서 진행되지만, 더 높은 온도는 적합하지 않다. 항원과 항체 반응은 4 C 에서 더욱 철저하고, 방치 검사에서 반응이 종종 냉장고에서 밤을 보내며 가장 많은 침전을 형성한다. 하지만 시간이 너무 오래 걸리기 때문에 ELISA 에는 일반적으로 사용되지 않습니다.
전용 전기 가열 블록이 있는 ELISA 기기를 제외하고 일반적으로 수욕으로 보온한다. 효소 표지판은 수조에 넣을 수 있고, 효소 표지판의 바닥은 수면에 붙여야 하므로 온도의 균형을 빠르게 조절할 수 있다. 증발을 피하기 위해 판을 덮기 위해, 판의 구멍도 플라스틱 밀봉지나 랩으로 덮어서 반응판이 물 위에 떠 있게 할 수 있다. 배양상자를 사용한다면 효소 표지판은 젖은 상자에 넣어야 한다. 젖은 상자는 금속 등 열전도성이 좋은 재료로 만들고 상자 바닥은 젖은 거즈를 깔아야 한다. 마지막으로, 효소 표지판은 젖은 거즈 위에 놓아야 한다. 젖은 상자는 배양함에서 규정된 온도로 예열해야 한다. 특히 온도가 낮을 때는 더욱 그렇다. 효소 표지판 바닥의 물기나 마모로 인한 판독 오차를 피하기 위해 일반적으로 송풍기 항온으로 보온한다. 이 과정에서 증발을 피하기 위해 효소 표지판 위에 종이를 붙여야 한다. 물욕이든 젖은 상자든 부화하든, 반응판은 각 판의 온도가 빠르게 균형을 이룰 수 있도록 접지 말아야 한다. 실온에서 부화하는 반응에 대해서는 작동 시 실온을 규정된 범위로 엄격히 제한해야 한다. 표준 실온은 20-25 C 를 가리키지만 구체적인 조작은 설명서 요구에 따라 조절할 수 있다. 실온에서 부화할 때 효소 표지판은 조작대에만 평평하게 놓을 수 있다. 부화의 온도와 시간은 규정에 따라 가능한 정확해야 한다는 점에 유의해야 한다. 정확한 시간을 보장하기 위해 한 사람이 동시에 두 개 이상의 판을 조작하고 측정하지 마십시오.
세탁
세탁은 ELISA 의 반응 단계는 아니지만 실험의 성패도 결정한다. ELSIA 는 세탁을 통해 유리와 결합의 효소 표시를 분리할 수 있다. 세탁을 통해 판구멍에 남아 있는 고체상 항원이나 항체 결합될 수 없는 물질과 반응 과정에서 비특이적으로 고체상 운반체에 흡착되는 간섭 물질을 제거했다. 폴리스티렌 등 플라스틱은 단백질에 대한 흡착이 보편적이므로 세탁할 때 이런 비특이적인 흡착 간섭 물질을 씻어내야 한다. 세탁은 ELISA 운영에서 가장 중요한 기술이라고 할 수 있으며 운영자의 높은 중시를 불러일으켜야 하며, 요구에 따라 엄격하게 세탁해야 하며 소홀히 해서는 안 된다.
일부 ELISA 기기에는 전용 자동 세척기가 장착되어 있으며, 두 가지 세탁 방법, 즉 침수와 흐르는 물 세탁이 있습니다. 프로세스는 다음과 같습니다.
(1) 침지: a. 구멍의 반응 용액을 흡수하거나 말린다. B. 세정액으로 과세척 (세정액으로 판구멍을 채운 후 버리다); C) 물에 담그고, 판구멍에 세정액을 채우고, 1-2min 을 고정시켜 간헐적으로 흔들면, 침지 시간을 마음대로 줄일 수 없다. 동굴 안의 액체를 빨아들이다. 흡입은 철저히 해야 하고, 펌프나 진공펌프로 빨아들일 수도 있고, 액체가 쓰러진 후 깨끗한 수건이나 흡수지로 두드릴 수도 있다. E. c 와 d 를 반복하여 3-4 회 세탁합니다 (설명에 명시된 대로). 간접법에서는 배경이 높으면 세탁 횟수나 침지 시간을 늘릴 수 있다.
침지 세척법은 종종 미량 적정판에 쓰인다. 세정액은 주로 비이온세제를 함유한 중성 완충액이다. 폴리스티렌 운반체와 단백질의 결합은 소수성이다. 비이온 세제는 소수기단과 친수기단을 모두 함유하고 있으며, 그 소수기단은 소수성 결합과 단백질의 소수기단을 결합하여 단백질과 고체상 전달체의 결합을 약화시킨다. 친수기단과 물 분자의 결합을 통해 단백질은 수용액 상태로 회복되어 고체상 운반체로부터 분리된다. 세정액 중의 비이온형 세제는 보통 토온 20 으로 농도가 0.05%-0.2% 사이일 수 있다. 0.2% 가 넘으면 고체상에 싸여 있는 항원이나 항체 등은 탈착되어 테스트의 감도를 떨어뜨린다.
(2) 흐르는 물세척법: 흐르는 물세척법은 원래 구슬 운반체를 세척하는 데 사용되었고, 세정액은 증류수, 심지어 수돗물에 불과했다. 씻을 때 특수한 장치가 붙어 있어 구슬이 흐르는 물의 영향으로 계속 굴러가게 한다. 2 분 연속 헹구고 액체를 빼낸 후 증류수에 2 분 정도 담갔다가 빼주세요. 물에 담그는 것은 목욕하는 것과 같고, 흐르는 물은 씻는 것은 샤워와 같다. 그 세탁 효과는 더욱 철저하고 간단하고 빠르다. 기존 실험에 따르면, 흐르는 물 세탁도 미량적정판 세탁에도 적용된다. 세척할 때 수류나 수압을 최대한 증가시켜 물이 판자 구멍 표면에 부딪쳐 세척이 더 잘 되도록 합니다 (이 방법은 키트에서 거의 사용되지 않음).
발색과 색도학
착색
발색은 ELISA 의 마지막 부화반응으로, 이때 효소는 무색 기질을 촉매하여 유색 산물을 생산한다. 반응 온도와 시간은 여전히 발색에 영향을 미치는 요소입니다. 일정 기간 동안 음성 모공은 무색을 유지할 수 있고, 양성 모공은 시간이 지날수록 더욱 색이 바뀐다. 온도를 적절히 높이면 발색을 가속화하는 데 도움이 된다. 정량측정을 할 때, 밑바닥을 넣은 후의 반응 온도와 시간은 가능한 정확해야 한다. 정성 측정의 발색은 실온에서 할 수 있으며, 시간은 일반적으로 엄격하게 통제할 필요가 없다. 때때로 양성대조공과 음성대조공의 발색상황에 따라 반응시간을 적당히 줄이거나 연장하여 제때에 판단할 수 있다.
일반 OPD 기질은 실외 온도 또는 37 C 에서 20 ~ 30 분 동안 반응한 후 발색이 깊어지지 않고, 반응 시간 연장 배경 값이 증가합니다. OPD 의 기질 용액은 빛을 만나면 스스로 변색되고, 발색 반응은 어두운 곳에서 진행되어야 한다. 발색반응이 끝날 때, 종료 용액을 첨가하여 반응을 종료한다. OPD 제품이 황산으로 종료된 후 색상은 오렌지색에서 갈색으로 바뀝니다.
TMB 는 빛의 영향을 받지 않기 때문에 실온에서 수술대 위에 놓을 수 있어 반응할 때 결과를 관찰할 수 있다. 그러나 실험 결과의 안정성을 보장하기 위해서는 적절한 때에 결과를 읽어야 한다. TMB 는 HRP 처리 후 약 40 분 정도가 최고조에 달했다가 점차 약해지고 2 시간 후 무색으로 완전히 사라졌다. TMB 의 종료 용액은 여러 가지가 있으며, 아질화물 나트륨, 12 탄기황산나트륨 (SDS) 등 효소 억제제는 반응을 중단할 수 있다. 이런 종결자는 오랫동안 파란색 (12-24 시간) 을 유지할 수 있어 시각적인 판단의 좋은 종결자이다. 또한 다양한 산성 종료액이 파란색에서 노란색으로 바뀌는데, 이 경우 특정 파장 (450nm) 에서 흡광도를 측정할 수 있습니다.
[화학] 색도 ...
비색하기 전에 깨끗한 흡수지로 판자 바닥에 붙어 있는 액체를 빨아들여야 하지만, 가능한 표면을 피한 다음 효소 표색계의 비색대 위에 판을 정확히 놓아야 한다. 연판을 캐리어로 하는 실험은 판을 표준 96 홀 받침대 위에 놓아야 색을 비교할 수 있다. 밑물 용액을 첨가하기 전에 연판의 가장자리를 잘라서 판이 착석대 안에 완전히 앉을 수 있도록 하는 것이 가장 좋다.
색을 비교할 때 먼저 증류수로 0 점을 보정하고, 베이스 구멍 (반응없이 바닥액만 넣는 구멍) 과 빈 구멍 (샘플을 생리염수나 희석액으로 대체하는 구멍) 을 측정하고 읽어 이번 실험의 시약 상태를 기록한다. 그런 다음 빈 구멍을 증류수로 0 점을 보정하고, 빈 구멍의 흡광도에서 위의 구멍의 흡광도를 뺀 다음 계산할 수 있습니다.
비색 결과의 표현은 이전에는 광밀도 (OD) 였으나, 지금은 규정에 따라 흡광도 (A) 를 사용하는데, 의미는 같다. 일반적인 표현은 문자 A 의 오른쪽 아래 모서리에 흡수 파장을 쓰는 것입니다. 예를 들어 OPD 의 흡수 파장은 492nm, 표현은 "A492nm" 또는 "OD492nm" 입니다.
효소 표시 색계
효소 표색계, 약칭 효소 표지기는 일반적으로 ELISA 결과의 흡광도 측정을 위한 광도계를 가리킨다. 고체 전달체의 형식에 따라 평판, 구슬, 시험관에 적합한 특수한 디자인이 있습니다. 많은 시약 회사들이 효소 표지기를 공급한다. 효소 표지기의 주요 성능 지표로는 판독 속도, 판독 정확도, 반복, 정확도 및 측정 범위, 선형도 등이 있습니다. 우수한 효소 표지기의 판독 값은 일반적으로 0.0 0 1, 정확도 1%, 반복 0.5% 까지 정확할 수 있다. 예를 들어 구멍의 측정 a 값이 1.083 인 경우 공기와 관련된 구멍의 실제 a 값은 1 .083 0.01(1) 이어야 합니다 효소 표지기의 측정 범위는 각 효소 표지기의 성능에 따라 다르다. 일반적인 효소 표기기는 0.000~2.000 으로, 새로운 효소 표기기의 상한선이 2.900 이상으로 확대되었다. 측정 가능한 상한을 초과하는 값은 일반적으로 "*" 또는 "초과" 또는 기타 기호로 표시됩니다. 우리는 측정 가능한 범위와 측정 가능한 범위보다 작은 선형 범위의 차이에 주의해야 한다. 예를 들어 효소 표지기의 측정 범위는 0.000~2.900 이고 선형 범위는 0.000~2.000 에 불과합니다. 이는 정량 ELISA 가 표준 곡선을 만들 때 주의해야 할 사항입니다.
효소 표기기는 햇빛이나 강한 빛 아래 놓아서는 안 되며, 작동 시 실온은15 ~ 30 C 에 있어야 한다. 사용하기 전에 판독 장치를 예열 15-30 분 동안 예열하면 판독 결과가 더욱 안정적입니다 (일부 효소 표시기 설명서에 예열이 필요하지 않다고 명시되어 있음).
A 값을 읽을 때는 파장 492nm 의 OPD 와 같이 제품에 민감한 흡수 피크를 선택해야 합니다. 일부 효소 표지기는 쌍파장 판독값, 즉 구멍당 두 번, 첫 번째는 최적의 파장 (W 1), 두 번째는 민감하지 않은 파장 (W2), 두 측정 사이에는 효소 표지판의 위치가 이동하지 않는 이중 파장 판독값을 사용할 수 있다. 예를 들어 OPD 는 492nm 을 W 1 으로, 630nm 을 W 2 로, 마지막으로 측정된 A 값은 그 차이 (W 1-W2) 입니다. 이중 파장 읽기는 컨테이너의 스크래치 또는 지문으로 인한 광학 간섭을 줄일 수 있습니다.
각종 효소 표지기의 성능이 다르므로, 사용할 때 기자의 설명은 상세해야 한다.
결과 판단
정성 측정
질적 판정의 결과는 검시된 표본에 검사 대상 항원이나 항체 포함 여부에 대해' 예' 또는' 아니오' 라는 간단한 답변을 각각' 양성' 과' 음성' 으로 표시한 것이다. "양성" 은 샘플이 측정 시스템에서 반응한다는 것을 의미합니다. "부정" 은 반응이 없음을 의미합니다. 질적 판단도 반정량의 결과를 얻을 수 있는데, 즉 역가로 반응의 강도를 나타낼 수 있으며, 본질적으로는 질적인 검사이다. 이런 반정량 측정에서 샘플을 시리즈 희석하고 검사하는데, 양성반응의 최고 희석도는 역가격이다. 역가에 따라 샘플의 반응성을 판단할 수 있는데, 이는 희석되지 않은 샘플의 색채 깊이를 관찰하여 강양성인지 약양성인지를 판단하는 것보다 더 정량적이다.
간접법과 샌드위치법 엘시아에서 정공의 색상은 음수 구멍의 색상보다 어둡다. 반면 경쟁 ELISA 에서 음성공의 색상은 양성공보다 짙다. 두 반응의 결과는 아래와 같이 서로 다른 방식으로 판단된다.
(1) 간접법과 샌드위치법
이런 반응의 질적 결과는 육안으로 판단할 수 있다. 표본이 무색이거나 무색에 가까우면 음성으로 판정되고, 색이 또렷하면 양성으로 판정된다. 그러나 ELSIA 에서는 정상인혈청반응 후 색색의 배경이 자주 나오는데, 이 배경의 깊이는 시약 구성과 실험 조건에 따라 다르기 때문에 실험에 여성대조를 첨가해야 한다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 남녀명언) 음성대조의 성분은 정상 혈청이나 시험물질을 함유하지 않는 유사체여야 한다. 육안으로 결과를 판단할 때는 음성대비 어두운 색을 표본의 양성지표로 사용하는 것이 더 적합하다.
눈시울법은 간단명료하지만 상당히 주관적이다. 조건이 허용하는 경우 색도계로 흡광도 값을 측정하여 객관적인 데이터를 얻을 수 있습니다. 먼저 샘플 (S), 양성 대비 (P) 및 음성 대비 (N) 의 흡광도 값을 읽은 다음 계산합니다. 계산 방법은 매우 많은데, 대략 두 가지 종류로 나눌 수 있다: 양성 판정법과 표본 대 음성 대조법.
A. 긍정적인 판단 값
일반 양성 임계값은 음성대비 A 값에 특정 상수를 더해 결과가 양성인지 음성인지를 판단하는 기준으로 한다.
이런 방법으로 결과를 판단하려면 실험 조건이 매우 일정해야 하고, 시약 조제는 반드시 규범적이어야 하며, 양수와 마이너스 대조품은 일정한 규범에 부합해야 하며, 반드시 정밀 기구를 사용하여 엄격하게 규정에 따라 조작해야 한다. 양성 판정값 공식의 상수는 이 특정 체계에서 대량의 표본에 대한 실험을 통해 검출된 것이다. 우리는 HBsAg 의 테스트 키트 검사를 예로 들었다. 테스트 키트 속 여성대조품은 HBsAg 를 함유하지 않은 복칼슘인 혈장이고, 양성대조품 중 HBsAg 의 함량은 P = 9±2 ng/ml 로 표기되어 있다. 실험당 2 개의 양성 대조군과 3 개의 음성 대조군이 있었다. A 값을 측정한 후 먼저 음성 대비 A 값 (NC X) 의 평균과 양성 대비 A 값 (PCX) 의 평균을 계산합니다. 두 평균의 차이 (P-N) 는 특정 값 (예: 0.400) 보다 커야 유효합니다. 3 개의 음성 대조군의 a 값은 ≥0.5×NCX 이고 ≤ 1.5×NCX 여야 한다. 그 중 하나가 이 범위를 벗어나면 삭제하고 다른 두 개의 음성 품질 관리 제품을 사용하여 ncx 를 다시 계산해야 합니다. 만약 두 개의 음성 대조의 한 값이 상술한 범위를 넘으면 실험은 무효이다. 다음 공식에 따라 양성 판단값을 계산합니다.
정면 판단 값 =NCX+0.05
A 값이 양성판단값보다 큰 표본은 양성이고, A 값이 양성판단값보다 작은 표본은 음성이다. 수식에서 0.05 는 테스트 키트 상수이며, 이 특정 조건에만 적용되며 다양한 시약 유형에 사용할 수 없다는 점에 유의해야 합니다.
앞서 언급한 바와 같이 음성대조와 양성대조는 이 방법의 검사 품질 관리에도 작용하며, 시약 변질과 조작이 부적절하면 모두' 검사 무효' 의 결과를 초래할 수 있다는 것을 알 수 있다.
B. 샘플/음성 품질 관리 비율
이 판단 방법은 실험 조건 (시약 포함) 이 상수를 보장하기가 어려울 때 더 적합합니다. 샘플과 음성 대조의 A 값을 얻은 후 S/N 값을 계산합니다. P/N 을 쓰는 사람도 있습니다. 여기서 P 는 양성이 아니라 patient 의 약어입니다. 오해하지 마세요. 혼동을 피하기 위해 s/n 을 사용하는 것이 더 적합했다. 초기 간접 ELISA 에서는 S/N 을 양성 기준으로 정한 저자가 있어 현재 각종 검사에 많이 사용되고 있다. 실제로 각 측정 시스템은 실험을 통해 자신의 신호 대 잡음비 임계값을 찾아야 합니다. N 으로 표시된 음성대조는 피실험물질이 없는 사람의 혈청이라는 점에 유의해야 한다. 일부 테스트 키트 중 음성 조절은 단백질이나 단백질을 함유하지 않는 완충액이므로 반응 후 생기는 배경은 정상인 혈청보다 훨씬 낮을 수 있다. 따라서 이러한 테스트 키트 사양 (예: n)
(2) 경쟁법
경쟁법 ELISA 에서 여성공의 색상은 양성공보다 더 짙다. 음의 발색의 강도는 효소 결합물의 농도와 반응에 첨가된 경쟁 억제제의 양에 달려 있다. 보통 음성대조의 흡광도 조정은 1.0- 1.5 사이에서 가장 민감하게 반응한다.
경쟁 ELISA 는 자체 관찰을 통해 결과를 판단하기가 쉽지 않다. 육안으로는 약한 양성반응과 음성대조의 색상 차이를 구별하기 어렵기 때문에 일반적으로 색계보다 S, P, N 의 흡수값을 읽어서 결정하는 두 가지 계산 방법, 즉 양성판단가치법과 억제율법이 있다.
A. 양수 판단 값 방법
간접법과 중간층의 양성평가법과 거의 같지만, 계산 공식에 양성대비 A 값이 도입되었다. 이제 항 HBc 테스트 키트 테스트를 예로 들어 보겠습니다. 테스트 키트 중 여성대조는 항항 -HBc 가 없는 복칼슘 혈장이고, 양성대조에서 항항 -HBc 함량은 125 100u/ml 이다. 실험당 2 개의 양성 대조군과 3 개의 음성 대조군이 있었다. A 값을 측정한 후 먼저 음성 대비 A 값 (NC X) 의 평균과 양성 대비 A 값 (PCX) 의 평균을 계산합니다. 두 평균 간의 차이 (N-P) 가 특정 값 (예: 0.300) 보다 커야 테스트가 유효합니다. 3 개의 음성 대조군의 A 값은 2.000 미만이어야 하며 ≥0.5×NCX 및 ≤ 1.5×NCX 여야 합니다. 그 중 하나가 이 범위를 벗어나면 삭제하고 × ncx 를 다른 두 개의 음성 대조로 다시 계산해야 한다. 만약 두 개의 음성 대조 A 가 상술한 범위를 벗어나면 실험은 무효이다. 다음 공식에 따라 양성 판단값을 계산합니다.
부정 판단 값 =0.4×NCX+0.6×PCX
A 값 ≤ 양수 판단값의 반응은 양수이고, A > 양수 판단값의 반응은 음수이다.
B. 억제율 법
억제율은 경쟁 결합에서 음성반응 발색의 억제 정도를 나타내며 다음과 같이 계산됩니다.
억제율 (%) = (음성 대비 A 값-표본 A 값) × 100%/ 음성 대비 A 값.
일반적으로 억제율 ≥50% 는 양성이고, < 50% 는 음성이다.
정량측정
ELSIA 의 조작 절차가 복잡하여 반응에 영향을 미치는 요인이 많다. 특히 고체 운반체의 코팅은 개인간 일관성을 달성하기 어렵다. 따라서 정량 측정에서 각 실험은 서로 다른 농도의 참조 기준을 사용하여 동일한 조건에서 표준 곡선을 만들어야 합니다. 고 분자량 물질을 측정하는 샌드위치 ELISA 는 일반적으로 더 넓은 표준 곡선 범위를 가지고 있으며, 곡선의 가장 높은 점의 흡광도는 2.0 에 가까울 수 있다. 그릴 때 일반적으로 반 로그 용지를 사용하여 측정된 물질의 농도를 가로좌표로, 흡광도를 세로좌표로 하여 각 농도 값을 점별로 연결합니다. 결과 곡선은 일반적으로 S 자 모양이며, 머리와 꼬리 곡선은 평평해지고 가운데 직선 부분은 가장 이상적인 감지 영역입니다.
경쟁법은 일반적으로 작은 분자량 물질을 측정하는 데 사용되며, 표준 곡선의 흡광도는 측정된 물질의 농도와 음의 상관 관계가 있다. 테스트 키트 에 사용된 모델 에 따라 표준 곡선 의 모양 이 약간 다르다.